Tredje världskriget närmar sig och det är bara en fråga om tid innan vi måste börja bunkra upp. I vår senaste artikel tittar vi på hur ni kan förbereda er på bästa sätt genom att tillverka ert eget vaccin.
Det råder ju inga direkta tvivel om att ett tredje världskrig ligger ganska nära i tiden och vi har gjort vårt bästa för att försöka förse er med information om hur man skulle kunna klara sig i ett sådant läge. Elektronisk utrustning kan enkelt störas ut av de magnetfält som skulle skapas vid ett regn av atombomber och på grund av det har forskare redan jobbat med att kunna spara data i bakterier och använda dem som batterier. Bakterier har en förmåga att kunna överleva det mesta så de är ett bra mål att fokusera forskningen kring.
Vi tänkte här att vi skulle presentera ytterligare en sak som kommer att underlätta när ett kärnvapenkrig skett. Faktum är att det bästa ni kan göra är att ge er på detta på en gång. Vi ska nämligen visa er hur ni kan tillverka ert egna vaccin. Metoden gör det möjligt att bygga många olika vaccin mot både virus och olika typer av bakterier.
Vi har dessutom vinklat det så att ni ska kunna utföra detta i ert eget kök. Ni får försöka se till att ha det någorlunda städat bara under det första skedet av tillverkningen. Sterilt är att föredra, men det är kanske inte helt möjligt.
På de kommande sidorna kommer vi att presentera ett uppslag för hur det skulle kunna gå till, men det är fritt fram att experimentera och försöka snygga till protokollet.
Jag kan börja med att presentera hur det här fungerar för den som inte är så insatt i hur virus och bakterier attackerar dig och dina celler, samt hur DNA och proteiner är kopplat.
Alla celler har proteiner som sitter på sin yta. Olika celler har olika proteiner. Genom åren så har virus och bakterier lärt sig att vissa proteiner finns på våra celler och kan binda till dessa och sedan ta sig in i cellerna och orsaka skada. Alla bakterier tar sig dock inte in i celler utan nöjer sig med att vistas bland cellerna.
DNA
Proteiner i vår kropp skapas utifrån en specifik och väldigt liten del vårat DNA. DNA avkodas dock inte direkt utan går vi ett par steg som involverar RNA, som är en spegelkopia av DNA. Problemet är att vi kan inte använda informationen som DNA bär för det finns en massa skräp i det som måste skäras bort först och det kan vi inte göra på konstgjord väg. Vi är tvungna att låta cellerna göra det åt oss och enklast är då att använda RNA istället, för där har all skräpinformation klippts bort.
Vi ska utnyttja detta i vår studie genom att ta en bit av det DNA som ger det protein som vi vet att vårt virus binder till och sätta ihop det med en annan bit DNA som kodar för ett annat protein. Detta andra protein kommer i vårt fall vara en del av en antikropp. Antikroppar är en del av vårat immunförsvar.
Vi kommer alltså att bygga ett helt nytt protein som virus kommer binda till istället och samtidigt kommer vårt immunförsvar att ta bort viruset.
På nästa sida följer lite förberedelser.
Ni undrar säkert hur man ska veta vilket protein jag ska försöka slå ihop med en antikropp för att kunna skydda sig. Det är dock inte så svårt att ta reda på. VirusTaxonomyonline.com innehåller i stort sett allt ni behöver veta om virus, medan Houston Medical School har en taxonomi över bakterier. Dock så kommer ni ju att behöva ha tillgång till dessa när ni ska sätta igång, vilket kanske betyder att det kan vara en bra idé att mata skrivaren med papper och börja skriva ut.
Men även om ni hittar rätt protein så måste ni på något sätt lyckas få fram denna ur den stora massan av DNA och RNA som det finns och detta gör ni genom en metod som kallas PCR (Polymerase Chain Reaction). Detta gör det möjligt att bara kopiera upp just den bit DNA som ni vill ha. Den som vill veta mer om hur man kan gå till väga kan titta på en artikel som Andersson, Bernander och Nilsson skrivit; Dual-genome primer design for construction of DNA microarrays. Artikeln handlar i och för sig om en alternativ tillverkningsmetod av primers, men den är samtidigt snabbare och effektivare.
Sekvenser för DNA och protein hittas enklast hos PDB.org, Swissprot och NCBI.
Ett exempel på hur PCR kan fungera
Vi har delat upp det i en process på tre dagar, eventuellt en sjunde med om du tvunget måste analysera ditt resultat … men innan du börjar kan det vara bra att förbereda en del och försöka göra en del lösningar någorlunda sterila.
Du kommer att behöva en del kemikalier under tidens gång, men inget av det är direkt farligt så ett par plasthandskar borde vara nog som skydd. Ugnsfläkten borde nog kunna dubblera som ett slags dragskåp med när du ska hantera och flytta bakterier.
Vinylhandskar från High Five
Det första vi behöver är en fosfatbuffert. Du kommer behöva ungefär 1,5 liter. Börja med att koka upp 1,5 liter vatten och slå i lite drygt 1,5 gram divätefosforsyra (H2PO4–) och 1,5 gram vätefosforsyra (HPO42-) och sedan 13g bordssalt (NaCl). Eller så gör du det enkelt för dig och beställer hem en färdig lösning från Sigma-Aldrich: P5368. Kostar lite mer, men du slipper arbeta.
Det du behöver göra härnäst är att blanda i ordning odlingsmedium för dina bakterier och för det så kommer du behöva lite antibiotika med och det är lite marigt att få tag på i hemmet tyvärr så det blir att vända sig till ett företag som tillverkar detta. Med tanke på att vi inte kommer jobba i en helt underbart steril miljö så känns det som att vi kan inte skippa det heller men det är fritt fram att våga chansa. Ampicillin, tetracyklin och kanamycin kommer att användas. De första bakterierna vi har är resistenta mot tetracyklin och de andra mot kanamycin. Alla celler som tar upp vår vektor (mer om det senare) är resistenta mot ampicillin. Det är olika typer och det är oerhört viktigt att inte blanda ihop dem för då kommer du att döda dina bakterier istället för att skydda dem mot föroreningar.
Du behöver framställa LB medium för odling. LB medium består av trypton, jästextrakt och natriumklorid uppblandat i vatten. Trypton finns att köpa från en mängd tillverkare, jästextrakt likaså. En lösning på drygt en liter borde vara nog; 10g trypton, 5g jästextrakt och 10g natriumklorid. Koka upp för att sterilisera … eller köp från Sigma; L2542.
Det sista du behöver göra i ordning och koka upp är 250ml CaCl2. Du löser bara 2,75g i 250ml och kokar upp. Förvara det sedan svalt, på is i kylen till exempel. Nästa problem ligger i att komma över 50ml helblod. Det tänker vi inte ta i med tång.
Innan vi går vidare så finns det en sak till som måste lösas, centrifugeringen. Det är ju inte alla som har tillgång till en centrifug kapabel till krafter uppemot 10 000g, men vi har en lösning åt er. Många av er har säkert tillgång till en tvättmaskin och genom att lägga denna ner och montera en tillräckligt lång slunga till den roterande trumman borde man kunna få till tillräckliga krafter. Den som vill ha en mer målande bild kan kolla in Spendrups klassiska reklam Robert Gustafsson (hoppas fram till del 3 vid ~1 min); YouTube.
Tvättmaskinscentrifug in action
Första dagen så måste du bereda cellerna som du ska använda för att odla upp rätt DNA. Vi kommer att använda oss av en rad kit och vi kommer att hänvisa till manualerna till dessa. Helt enkelt för att all information finns där redan,
Vi börjar dock med rena fram rätt celler från det 50ml med helblod. Detta görs genom Ficoll-Paque, som finns att köpa från GE HealthCare. Instruktioner medföljer och finns online här. Efter det måste du tyvärr räkna antalet celler du har i ditt prov. Det finns inget riktig säkert sätt att göra det i hemmet så vi skippar det helt enkelt. Härnäst så ska vi extrahera RNA, alltså spegelbilden av DNA, från dessa celler och för det kan du använda GenElute från Sigma; RTN10.
Nu tar vi tag i bakterierna. Det finns faktiskt folk som spenderat en livstid med att avla fram oerhört specifika arter av bakterier och det kommer vi utnyttja nu. Novagen har två typer av E. coli som vi kommer att använda. E.coli är den där härliga tarmbakterien som är den i särklass vanligaste orsaken bakom urinvägsinfektioner. Den första typen vi kommer använda kallas för Nova Blue och är bra på att skapa DNA.
Närbild på E. coli (Rocky Mountain Laboratories, NIAID, NIH)
Ta 40ml LB medium och tillsätt 40µg tetracyklin och lika mycket ampicillin. Kan vara lite marigt att väga upp. Sätt till bakterier och låt det växa till det blir lite grumligt.
Under tiden så kan du jobba vidare med ditt RNA. Genom att använda Superscript II från Invitrogen så kan man omvandla RNA till DNA igen och få fram den bit DNA som kodar för den bit protein vi vill ha. Problemet är att härnäst måste ni köra en PCR-reaktion där ni först måste konstruera primers och ha tillgång till en PCR-maskin. Hur ni ska göra det i ett kök har vi ingen aning om så det får ni lösa själva.
När cellerna blivit grumliga så kör ni igång tvättmaskinscentrifugen lagom så att ni når krafter på runt 5,000g och kör cellerna i denna i runt 10 minuter. Häll av vätskan som ligger ovanpå och försök lösa upp klumpen med celler i några milliliter av din iskalla kalciumkloridlösning som berett sedan innan. Gör om centrifugeringen, slå av vätskan och lös upp cellerna som ligger i botten. Håll lösningen på is.
Ta nu din PCR-produkt och tvätta den ren från artefakter och annat ointressant DNA genom att använda Geneclean II från Bio 101, Protokollet finns på samma sida. Nu ska vi föra in ditt DNA i bakterierna, men först måste vi sätta in det i en slags transportör, vektor, som även innehåller en del annan information. Vi kommer att använda pET32a(+) från Novagen i detta experiment eftersom den erbjuder inte bara många klyvningsställen utan också fina uppreningsmöjligheter av det färdiga proteinet..
Parallellt som du renar fram dina T-celler i inledningen ska du även ta reda på B-cellerna och behandla dom på samma sätt som du gjort med dina T-celler. Du klyver sedan upp dina två DNA-strängar med hjälp av enzymer från Fermentas. NcoI och SalI för DNA från T-celler och HindIII samt SalI för DNA från B-celler. Du renar sedan upp båda med hjälp av Geneclean-kitet frå Bio 101.
Du klipper först upp din vektor med HindII och SalI och ska sedan sätta samman dina två DNA-strängar med din vektor. Börja med att blanda DNA från B-cellerna och vektorn med DNA ligas från Fermentas. Låt stå i rumstemperatur i en timme. Rena upp din vektor genom att använda Wizard miniprep från Promega. Blanda sedan din vektor med enzymerna för NcoI och SalI, samt ditt DNA från T-cellerna.
Vår vektor: pET-32a(+), klicka för större
De E.coli som du tidigare satt på is kan du nu ta fram och tillsätta 0,2ml av till din vektorblandning. Låt det stå på is i 20 minuter och sedan i 42°C (ungefär 80% av 50°C om du tänkt använda ugnen) i 45 sekunder. Sätt till 0,4ml LB-medium och låt det stå i en timme. Här efter skulle man kunna göra en koll på vilka bakterier som faktiskt tagit upp vektorn, men vi får nog hoppa det i brist på tid när vi känner pressen från de invaderande finländarna. Efter det låter vi det stå i rumstemperatur över natt.
Innan du loggar ut för dagen måste du förbereda nästa typ av bakterier som vi ska flytta vektorn till. Den här typen vi använder nu är bra på att multiplicera vektorer, men den är inget vidare på att göra proteiner, vilket är vad vi i slutändan vill ha (E.coli Bl21trx är bra på det). För att det ska fungera måste vi ha bra med vektorer först och främst dock. Gör i ordning ett rör eller behållare med 5ml LB-medium med kanamycin 12µg/ml som du sätter dina bakterier till. Du behandlar dessa sedan på samma sätt som du gjorde med den första omgången bakterier.
Nästa dag så renar du sedan fram vektorn genom Wizard miniprep en gång till och för sedan in vektorn
i de nya bakterierna på samma sätt som med de tidigare. Låt stå över natt.
Nästa dag så pytsar du upp en stor bägare med 200ml LB-medium och denna innehåller då både ampicillin och kanamycin. Du uppskattar grumligheten på bägaren tills du känner att den blivit tillräcklig och tillsätter sedan några droppar IPTG. Detta kommer att göra att bakterierna kommer att gå in i ett läge där de kommer att producera ditt protein som om de aldrig gjort något annat.
Ett fusionsprotein mot Rhinovirus
Nu har du faktiskt ditt protein och hur man väljer att få ut proteinet från allt annat är helt upp till dig. Det finns många olika saker man skulle kunna göra. Utnyttja tvättmaskinscentrifugen är en variant, men det blir svårt att bli av med proteiner av likartad storlek då. Kromotografi är nog det som är enklast, men var i hela friden ni ska få tag på de geler som skulle behövas mitt under ett tredje världskrig har vi ingen aning om. Lycka till med det!
